Comenzamos los experimentos con los pimientos

Tras unas clases en las que nos hemos ido familiarizando con algunas de las técnicas que vamos a emplear, hoy hemos comenzado las sesiones en las que desarrollaremos la parte experimental de nuestro proyecto. Finalmente vamos a llevar a cabo nuestros ensayos con pimientos (Capsicum annum),  concretamente de la variedad dulce italiano. Este es el pimiento verde que solemos consumir en nuestras casas y el que habitualmente se emplea para freír. 

La sesión ha estado dirigida por José Manuel Palma y por otras dos investigadoras de la Estación Experimental de Zaidín, María Jesús Campos y María Ángeles Muñoz-Vargas. En la primera parte de la clase, José Manuel ha presentado la secuencia de experimentos que vamos a realizar y que se pueden ver en la tabla que se incluye a continuación. Estudiaremos tres situaciones: conservación a temperatura ambiente, en el frigorífico (4-8ºC) y en el congelador (-20ºC). Y valoraremos los parámetros que se especifican durante cuatro semanas: Pesos fresco y seco, Brix (porcentaje de azúcares solubles), pH, vitamina C, proteínas totales, y algunos pigmentos como son la clorofila y los carotenoides.

Seguidamente se ha procedido a numerar y a organizar los pimientos para los próximos experimentos. Se han pesado todos y se han preparado para las pruebas que se iban a realizar hoy. El resto se ha guardado en bolsas de plástico a temperatura ambiente, en el frigorífico y el congelador. 

Sobre el propio jugo del pimiento obtenido por presión en una jeringa de plástico en la que se ha incluido una malla de nylon para filtrar los restos, se ha medido el pH y el brix. Este último se mide con un refractómetro y sirve para indicar la cantidad de azúcares solubles que contiene el pimiento. 

Se han obtenido extractos en tampón Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, para la posterior determinación de vitamina C y de proteínas totales, y extractos en etanol al 96% (v/v) para la valoración de la concentración de clorofilas y carotenoides. Se han centrifugado dichos extractos para eliminar los restos y se han guardado en el congelador. 

Tras la sesión, es el momento de compartir los datos que hemos obtenido y de hacer un análisis de nuestros resultados. Para ello utilizaremos la sección de comentarios. A medida que recibamos vuestros datos los iremos reflejando en el blog para que todos tengamos acceso a toda la información.

Experimentos previos: ¿cómo ha evolucionado la cantidad de vitamina C en las hojas de espinaca?

A lo largo de una semana hemos ido valorando cómo ha evolucionado el peso en nuestras hojas de espinacas, tanto dentro como fuera del frigorífico. Recordemos que en ningún caso las hojas se han almacenado guardadas en bolsas de plástico. La figura siguiente muestra gráficamente cómo ha sido esta evolución:

A lo largo de estos días también hemos medido la temperatura a la cual se han mantenido las espinacas. Los datos se muestran en el gráfico siguiente:

Paralelamente hemos ido valorando la cantidad de vitamina C presente en nuestras muestras por el método del lugol que describíamos en entradas anteriores. Tras una medida inicial llevada a cabo el 9 de febrero, volvimos a valorar la concentración de ácido ascórbico (vit. C) el 14 y el 16 de febrero. Los resultados de las distintas medidas se muestran en la tabla siguiente, en la que se indica cómo se han almacenado las hojas, la cantidad de espinacas que se tomó para el extracto, la cantidad de agua en la que se hizo y el volumen de lugol utilizado para valorar la cantidad de vitamina C.

 

A partir de estos datos calcularemos la cantidad de vitamina C presente en nuestras muestras según la ecuación que dábamos en la entrada anterior. Calcularemos el valor medio para cada situación y expresaremos nuestros valores en función del peso de hojas de espinacas. Recordemos que para la valoración de vitamina C poníamos 1 ml de extracto. Con este valor, calcularemos el total de vitamina C que habría en el volumen de extracto (consideraremos el volumen de agua añadida) y lo dividiremos por los gramos de hojas que pusimos. Con ello tendremos una estima de la cantidad de vitamina C por cada gramo de hoja.

Un dato que quizá pueda ser interesantes y necesario para una intepretación adecuada de nuestros resultados es la pérdida de peso de las hojas, que en principio atribuiremos a su desecación y por tanto a la pérdida de agua. A efectos de posibles cálculos quizá sea interesante saber que el día 14 de febrero el peso de las espinacas dentro del frigorífico era de un 64,6% el inicial y fuera de un 48,8%. Y el día 16, estas cifras se habían reducido respectivamente a un 57,3% y a un 32,7%.

Una vez hecho esto toca interpretar nuestros resultados y hacer una discusión de los mismos. Compartiremos las conclusiones en la sección de comentarios.

Primeros pasos con el espectrofotómetro

En la entrada anterior describíamos la técnica para valorar la vitamina C. En esta aprenderemos a medir con el espectrofotómetro. Este es un instrumento muy útil que nos servirá para estimar la cantidad de pigmentos que hay en nuestras muestras, sobre todo clorofila y carotenoides. El espectrofotómetro mide la cantidad de luz que absorbe o que se transmite a través de una disolución. Consta de  un emisor de luz, cuya longitud de onda (color) podemos seleccionar, y que hacemos pasar a través de una cubeta en la que ponemos la muestra a medir. Un detector medirá la cantidad de luz absorbida  o transmitida una vez que cruce a través de la muestra, y nos devolverá un valor en el monitor. Necesitaremos calibrar el aparato, para lo que utilizaremos lo que llamamos un blanco que consiste en el disolvente que emplearemos para la extracción de nuestros pigmentos. De esta forma, restaremos la posible absorción de luz por el disolvente, por lo que las diferencias en las medidas se deberán a la mayor o menor concentración de pigmentos.

Arturo nos traído espinacas. Se recolectaron el domingo pasado en Notáez, un pueblo de la Alpujarra. Las hemos utilizado para hacer una valoración de vitamina C con el método que ya describimos en su momento, y para familiarizarnos con el espectrofotómetro y ver el espectro de absorción de los extractos vegetales.

Para el ensayo de la vitamina C empezamos utilizado las mismas cantidades de espinacas que de pimientos en el experimento de la clase anterior. Pronto observamos que no era factible el protocolo pues se absorbía demasiada cantidad de agua por la masa vegetal y se obtenía una solución con un color muy intenso que impedía ver el cambio en el indicador al aplicar la reacción del lugol. Resolvimos este problema diluyendo la muestra y añadiendo más cantidad de agua, o bien preparando un extracto con 2 gramos de espinacas y 10 ml de agua destilada. El resto del procedimiento fue el descrito en la entrada anterior.

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Para el análisis espectrofotométrico de los pigmentos vegetales, trituramos 2 gramos de hojas de espinacas con 10 mililitros de etanol al 80% (v/v) en agua. El extracto se filtró; se tomaron 2 ml del mismo y se centrifugaron para eliminar los restos vegetales. Utilizamos por primera vez en un experimento la microcentrífuga (ver debajo) con la que se nos dotó por parte del proyecto CAOS en el curso anterior.

 

Con este procedimiento, eliminábamos los restos vegetales de forma que tuviésemos un extracto limpio para poder medir en el espectrofotómetro, el cual se depositó en la correspondiente cubeta. Como blanco utilizamos etanol al 80% (v/v).

 

Para utilizar el espectrofotómetro lo conectamos mediante el interruptor POWER (posición ON, ver imagen debajo). Para medir en el visible, debe estar en posición ON el conmutador de la lámpara de tungsteno (W). Deberemos dejar que el aparato se caliente durante unos diez minutos. Si midiéramos en el ultravioleta, deberíamos encender el conmutador 6 (HEAT D2).

Pondremos el selector de escalas (RANGE) en la posición 0-100%. Ajustaremos sin poner cubeta al 0% con el mando de ajuste de cero (0% ADJ). 

Para medir la absorbancia ponemos el selector RANGE en la posición ABS 0-2, y colocamos la cubeta del blanco en el portamuestras. A continuación, ajustamos a 0 con el con el botón % ADJ y, posteriormente, colocamos la cubeta con la muestra problema. Cuando se estabilice el visor-monitor tomaremos la lectura que muestre. Si el medidor rebasa el límite (lo apreciaremos porque parpadea) cambiaremos el selector RANGE a la posición ABS 0-3.

Las primeras mediciones de absorbancia de los pigmentos vegetales las realizaron Elsa y Lin. Los datos obtenidos se representan gráficamente en la figura siguiente.

Como hemos dicho al principio, también hicimos valoraciones de vitamina C en las hojas de espinaca. ¿Cuáles fueron vuestros resultados? Por favor, compartidlos en la sección de comentarios junto con vuestra valoración de la sesión.

Aprendiendo a valorar la vitamina C

La vitamina C, también conocida como ácido ascórbico, es un potente antioxidante que no es exclusivo de frutos cítricos, como las naranjas o los limones. Algo que no es muy sabido es que otras muchas frutas y verduras son también muy ricas en este compuesto.

Para valorar la cantidad de vitamina C que hay en una muestra debemos utilizar una reacción específica que nos permita cuantificarla. El almidón es un polisacárido que reacciona específicamente con el lugol, un compuesto que tiene iodo. Si a una solución de almidón le añadimos unas gotas de lugol, se tornará violeta oscuro. La vitamina C previene frente a esta reacción, por lo que si añadimos a la solución de almidón vitamina C, no aparecerá el color morado mientras ésta no se consuma en esa reacción. Cuánto más ácido ascórbico contenga la solución con almidón, más lugol tendremos que añadir para conseguir que aparezca el color morado en el tubo de ensayo. Y esto se rige por una reacción estequiométrica. O sea que la reacción del lugol con el ácido ascórbico o con el amidón se lleva a cabo de manera equilibrada y proporcional. Así, cuando en dichas reacciones se acabe uno de los componentes, no habrá más reacción por mucho que se añada el otro componente.

Este es el fundamento para realizar, primeramente, una curva patrón. Hemos preparado varias soluciones de vitamina C  con distintas concentraciones de ácido ascórbico comercial. Por otro lado hemos preparado una solución de almidón al 0,5% (peso de almidón/volumen de agua destilada). En cada tubo de ensayo pondremos 2 ml de esta solución de almidón a la que añadiremos 1 ml de las distintas preparaciones de vitamina C. Inmediatamente, con ayuda de una micropipeta, iremos añadiendo cantidades crecientes de lugol hasta que aparezca el color azul oscuro en el tubo. La curva patrón que hemos obtenido es la siguiente:

Esta curva nos permite predecir qué cantidad de lugol necesitaremos para que nos dé positiva la reacción ante una cantidad de vitamina C conocida. Pero alternativamente, y esto es lo importante, conociendo la cantidad de lugol añadido, sabremos que cantidad de ácido ascórbico tendremos en una muestra, ya que la reacción se rige por las leyes de la proporcionalidad, o sea estequiométricas, como se dijo antes. Un sencillo procedimiento matemático nos permite, además, obtener una ecuación (la ecuación de la recta de regresión que vemos en la figura) que nos ayudará a relacionar ambos valores. Basta con sustituir en la fórmula el volumen de lugol empleado.  En nuestro caso la ecuación se expresa de la siguiente forma:

Volumen de lugol en microlitros = 95,479 · cantidad de vitamina C (en un mililitro)

Para calcular la cantidad de vitamina C que tenemos en las muestras, despejamos esa incógnita según la expresión:

Cantidad de vitamina C =  volumen de lugol / 95,479

Para aprender a aplicar la técnica que hemos descritos vamos a averiguar el contenido de vitamina C en variedades de pimiento de distinto color. Los extractos se han preparado triturando 10 gramos de pimiento con 10 ml de agua. Una vez obtenido el homogeneizado, se filtra y sobre la solución obtenida se añaden con ayuda de una pipeta automática cantidades crecientes hasta que el tubo cambie de color y adquiera un tono azulado. Con ese valor aplicamos la ecuación anterior y tendremos la cantidad de vitamina C en cada una de las muestras.

¿Hemos obtenido valores semejantes para los tres tipos de pimientos? Compartid vuestros resultados en la sección de comentarios.