Primeros pasos con el espectrofotómetro

En la entrada anterior describíamos la técnica para valorar la vitamina C. En esta aprenderemos a medir con el espectrofotómetro. Este es un instrumento muy útil que nos servirá para estimar la cantidad de pigmentos que hay en nuestras muestras, sobre todo clorofila y carotenoides. El espectrofotómetro mide la cantidad de luz que absorbe o que se transmite a través de una disolución. Consta de  un emisor de luz, cuya longitud de onda (color) podemos seleccionar, y que hacemos pasar a través de una cubeta en la que ponemos la muestra a medir. Un detector medirá la cantidad de luz absorbida  o transmitida una vez que cruce a través de la muestra, y nos devolverá un valor en el monitor. Necesitaremos calibrar el aparato, para lo que utilizaremos lo que llamamos un blanco que consiste en el disolvente que emplearemos para la extracción de nuestros pigmentos. De esta forma, restaremos la posible absorción de luz por el disolvente, por lo que las diferencias en las medidas se deberán a la mayor o menor concentración de pigmentos.

Arturo nos traído espinacas. Se recolectaron el domingo pasado en Notáez, un pueblo de la Alpujarra. Las hemos utilizado para hacer una valoración de vitamina C con el método que ya describimos en su momento, y para familiarizarnos con el espectrofotómetro y ver el espectro de absorción de los extractos vegetales.

Para el ensayo de la vitamina C empezamos utilizado las mismas cantidades de espinacas que de pimientos en el experimento de la clase anterior. Pronto observamos que no era factible el protocolo pues se absorbía demasiada cantidad de agua por la masa vegetal y se obtenía una solución con un color muy intenso que impedía ver el cambio en el indicador al aplicar la reacción del lugol. Resolvimos este problema diluyendo la muestra y añadiendo más cantidad de agua, o bien preparando un extracto con 2 gramos de espinacas y 10 ml de agua destilada. El resto del procedimiento fue el descrito en la entrada anterior.

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Para el análisis espectrofotométrico de los pigmentos vegetales, trituramos 2 gramos de hojas de espinacas con 10 mililitros de etanol al 80% (v/v) en agua. El extracto se filtró; se tomaron 2 ml del mismo y se centrifugaron para eliminar los restos vegetales. Utilizamos por primera vez en un experimento la microcentrífuga (ver debajo) con la que se nos dotó por parte del proyecto CAOS en el curso anterior.

 

Con este procedimiento, eliminábamos los restos vegetales de forma que tuviésemos un extracto limpio para poder medir en el espectrofotómetro, el cual se depositó en la correspondiente cubeta. Como blanco utilizamos etanol al 80% (v/v).

 

Para utilizar el espectrofotómetro lo conectamos mediante el interruptor POWER (posición ON, ver imagen debajo). Para medir en el visible, debe estar en posición ON el conmutador de la lámpara de tungsteno (W). Deberemos dejar que el aparato se caliente durante unos diez minutos. Si midiéramos en el ultravioleta, deberíamos encender el conmutador 6 (HEAT D2).

Pondremos el selector de escalas (RANGE) en la posición 0-100%. Ajustaremos sin poner cubeta al 0% con el mando de ajuste de cero (0% ADJ). 

Para medir la absorbancia ponemos el selector RANGE en la posición ABS 0-2, y colocamos la cubeta del blanco en el portamuestras. A continuación, ajustamos a 0 con el con el botón % ADJ y, posteriormente, colocamos la cubeta con la muestra problema. Cuando se estabilice el visor-monitor tomaremos la lectura que muestre. Si el medidor rebasa el límite (lo apreciaremos porque parpadea) cambiaremos el selector RANGE a la posición ABS 0-3.

Las primeras mediciones de absorbancia de los pigmentos vegetales las realizaron Elsa y Lin. Los datos obtenidos se representan gráficamente en la figura siguiente.

Como hemos dicho al principio, también hicimos valoraciones de vitamina C en las hojas de espinaca. ¿Cuáles fueron vuestros resultados? Por favor, compartidlos en la sección de comentarios junto con vuestra valoración de la sesión.