Nuevos experimentos: parámetros bioquímicos de los pimientos, 22 de marzo de 2023

Teníamos previsto realizar nuestros experimentos para ver cómo varían determinados parámetros bioquímicos en los pimientos almacenados a temperatura ambiente el próximo viernes. Pero el estado en el que nos los hemos encontrado -se muestran en la imagen de abajo- nos ha hecho que adelantemos a hoy los experimentos.  Puesto que hemos usado trozos del mismo fruto para las determinaciones en ambos días, los pimientos han comenzado a deteriorarse por las zonas donde estaban cortados y a proliferar los hongos. Como datos morfológicos de interés, aparta de la contaminación por hongos y la podredumbre en las zonas de los cortes, destacar la pérdida observable de agua -véanse las arrugas en la imagen- y el enrojecimiento del pimiento verde y el aumento de intensidad en el color dele pimiento rojo.

Los resultados de las determinaciones bioquímicas se muestran a continuación, junto a los valores obtenidos el día anterior, el 10 de marzo de 2023. 

1. Resultados de la valoración del pH

2. Resultados de la valoración del Brix

3. Resultados de la valoración de vitamina C

4. Resultados de la determinación de proteínas

 5. Resultados de la valoración de pigmentos

Con lo arriba expuesto tenemos todos los datos necesarios para el análisis de nuestros pimientos tipo California de la variedad Melchor. Es ahora momento de efectuar los cálculos pertinentes para tener los valores apropiados. Aunque para una valoración inicial, los datos que tenemos nos pueden proporcionar mucha información a nivel comparativo. Y es necesario que ya vayamos analizando los datos, plantear si hay que repetir algún experimento y sacar las conclusiones oportunas.

Y hay un aspecto muy interesante sobre el que debemos reflexionar. Y es el hecho de que inicialmente, los pimientos eran recolectados directamente de la mata con distinto grado de madurez, por eso uno era verde y el otro rojo. Pero en el desarrollo de nuestros experimentos, hemos visto cómo se ha producido la maduración del pimiento verde y cómo se ha transformado en rojo en casi su totalidad. Aunque también hay signos de envejecimiento del fruto. Esto quizá nos permita, y aquí es muy importante lo que digan nuestros investigadores, comparar dos procesos de maduración a nivel de los parámetros bioquímicos que estamos estudiando.

Determinamos el contenido en proteínas de nuestros pimientos

Este viernes hemos procedido a hacer la determinación bioquímica que nos quedaba pendiente, el análisis de las proteínas presentes en los pimientos. El método que hemos usado es el de Bradford. Junto a un blanco compuesto por 800 µl de agua destilada y 200 µl de reactivo de Bradford, hemos preparado las muestras poniendo 5 µl de extracto de pimientos con 795 µl de agua destilada y 200 µl de reactivo de Bradford en tubos ependorf. A partir del extracto en tampón TRIS se han preparado cinco muestras de cada tipo de pimiento. Hemos mezclado bien los distintos productos y hemos esperado un mínimo de 10 minutos para llevar a cabo las lecturas en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 595 nm. Los resultados se exponen en la siguiente tabla:

Y de nuevo tenemos resultados anómalos en los pimientos verdes. En las determinaciones realizadas por los estudiantes, salen valores muy distintos. Por el contrario, en el caso de los rojos, los resultados son similares. Al igual que con la determinación de vitamina C, el profesor hizo tres medidas para cada tipo de pimiento. Los resultados están en la misma tabla.

Como decimos, los resultados de las distintas medidas de los pimientos rojos son más o menos coherentes. Sin embargo, en el conjunto de los resultados para los verdes, hay dos valores que se alejan mucho por arriba y uno por abajo (0,567 y 0,475 frente a 0,230). Parece razonable eliminarlos y realizar los cálculos con el resto. Tenemos los datos de la curva patrón y solo nos queda calcular la media de los valores anteriores y aplicar la ecuación de regresión. 

Ya tenemos realizada la primera fase de nuestro proyecto y ya podemos establecer las diferencias que hay entre los tipos de pimientos. La siguiente tarea va a ser llevar  a cabo todos los cálculos y ver qué diferencias existen entre los pimientos verdes y los rojos. Ayudándonos de la bibliografía deberemos sacar las conclusiones oportunas. Toca, pues, realizar un breve informe que compartiremos en la sección de comentarios.

Crónica y valoración de nuestros últimos resultados por Iván Molina Morillo

El pasado 15 de marzo tuvo lugar la segunda sesión experimental del proyecto en la que el objetivo era realizar las mediciones de vitamina C y proteínas a partir de los extractos que elaboramos la sesión anterior y siguiendo un procedimiento concreto. Sin embargo, únicamente pudimos hacer la determinación de la vitamina C.

Para ello, debemos seguir el llamado “Método del lugol”. En primer lugar extraemos con una micropipeta 2 mL de una disolución acuosa de almidón 0,5 M y añadimos 1 mL de nuestros extractos tamponados. Esto lo hicimos tres veces tanto con nuestros extractos de pimientos rojos y verdes como con los que realizó el profe. A continuación, se añade lugol hasta que aparezca un cambio de color (oscuro) y anotamos el volumen (en microlitros) empleado. Finalmente, a partir de la ecuación de la recta calculamos la cantidad de vitamina C. 

Los datos de las distintas mediciones se pueden observar en la entrada anterior. Como estos no nos parecieron demasiado coherentes (los valores para los pimientos verdes eran comparables, pero no así para los rojos), decidimos realizar las medidas con los extractos del profe. 

Lo desconcertante fue que estos resultados eran aún más incoherentes debido a los altos valores que obtuvimos en los pimientos verdes. Esto planteaba un problema, ¿qué ha ocurrido que pueda explicar dichos valores?

Como no tuvimos más tiempo, el profe realizó nuevamente unas medidas que por fin eran coherentes con la primera determinación y con los valores de los verdes nuestros.

Si comparamos los resultados, podemos ver que hay una variación de unos 40 microlitros aproximadamente, lo cual es normal considerando que este método no es el más exacto además de que probablemente cometiéramos imperfecciones a la hora de preparar los extractos, medir el lugol, etc. Sin embargo, las diferencias son mucho mayores en las mediciones que realizamos con los extractos del profe, especialmente en las de los pimientos verdes. Esa variación merece que nos detengamos a analizar cuál ha podido ser la causa.

Teniendo en cuenta que este método se basa en una reacción entre el lugol y la vitamina C, la razón estará en las medidas de alguno o ambos reactivos. Por un lado, al ser la vitamina C el reactivo limitante, si los valores de lugol salieron tan altos debe ser porque había más vitamina C. Esto se traduce en que debimos de medir más de 1 mL de extracto de pimiento.

Por otro lado, el problema pudo estar en la medición de lugol. Probablemente, ajustamos la micropipeta en un valor menor del que pensábamos y cada vez que echábamos el lugol estábamos contando más del que creíamos. También se puede deber a que cargábamos mal la micropipeta.

Por último, este método no es tan exacto y presenta algunos inconvenientes que también pudieron ser la causa de las variaciones en las medidas. El hecho de que se base en la capacidad reductora de la Vit C hace que la presencia de otros agentes reductores aumenten la cantidad calculada de Vit C. Otro inconveniente es la facilidad con la que se hidroliza el almidón dando lugar a la presencia de glucosa que también tiene poder reductor. Por último, hay que tener en cuenta que la Vit C se oxida con facilidad por el aire, por lo que es aconsejable preparar la solución de Vit C y almidón justo antes de realizar la titulación. En este caso, las disoluciones en las que obtuvimos las anomalías llevaban cierto tiempo preparadas, por lo que esto pudo afectar. Sin embargo, esta última teoría es bastante más improbable y difícil de demostrar.

En conclusión, prácticamente podemos afirmar que la incoherencia de los resultados se debe  a errores a la hora de medir los volúmenes. Debemos procurar ser más precisos y esta experiencia también nos sirve para aprender que no siempre podemos obtener los resultados que queremos y esto no debe desilusionarnos.

Por otro lado, también tenemos datos de pH. Con el pHmetro digital que hemos recibido hemos obtenido los siguientes valores:
Pimiento verde: pH = 5,9
Pimiento rojo: pH = 5,1

Determinamos el contenido de vitamina C de nuestros pimientos

En nuestra sesión de hoy del proyecto hemos procedido a valorar el contenido de ácido ascórbico (vitamina C) de nuestros pimientos. La técnica, puesta a punto en nuestro laboratorio, se basa en la capacidad del lugol de unirse a los granos de almidón y de teñirlo de color violeta. La vitamina C previene este proceso, de modo que mientras esté presente en el medio no aparecerá color en nuestra disolución al añadir lugol. 

Para el procedimiento hemos preparado tubos de ensayo a los que hemos añadido 2 ml de solución de almidón en agua al 0,5%; a estos le hemos añadido 1 ml de extracto de pimiento y hemos añadido lugol hasta que aparecía el color.

Hemos hecho las pruebas con dos extractos, uno obtenido por vosotros y otro que preparé yo, pues me pareció que podría faltar para las pruebas que teníamos que realizar. Sobre este extracto hice unas medidas cuyos resultados se muestran en la tabla:

Los resultados obtenidos por vosotros en la clase de hoy han sido los siguientes:

Los valores obtenidos para el pimiento verde en el extracto de los alumnos no muestra unos valores demasiado diferentes, al igual que la única determinación de vitamina C para el pimiento rojo. Sin embargo, si se han obtenido diferencias muy apreciables en el caso de la determinación con el extracto que yo obtuve para los pimientos verdes, con cantidades de lugol empleadas mucho más altas. Eso me ha llevado a hacer una nueva valoración con el extracto que preparé. Los resultados son los siguientes:

Los valores que claramente se alejan de los demás son los obtenidos por vosotros para el pimiento verde en el extracto que yo preparé, con valores muy superiores al resto.

Esto son cosas que suceden en el laboratorio y de las que también podemos aprender. En este caso, la cuestión es ¿cuáles han podido ser las causas que explican esas diferencias? Puesto que los extractos vienen del mismo pimiento, algo habrá fallado. ¿Qué puede ser? Esperamos vuestro análisis en los comentarios. 

Con estos datos ya podemos ir haciendo nuestros cálculos para obtener las cantidad de vitamina C que tienen nuestros pimientos por gramo de fruto. Tomaremos como volumen de lugol, la media de los valores obtenidos en todas las mediciones para cada tipo de pimiento, a excepción de los comentados para el pimiento verde en el extracto que yo preparé y que ha mostrado resultados anómalos.

Por otro lado, también tenemos datos de pH. Con el pHmetro digital que hemos recibido hemos obtenido los siguientes valores:

Pimiento verde: pH = 5,9

Pimiento rojo: pH = 5,1

Cuánto más bajo es el valor de pH en una muestra mayor es la acidez, mayor la concentración de protones en la muestra. La diferencia entre ambos pimientos es el grado de maduración de los mismos, siendo el rojo el más maduro. ¿Qué pude explicar el descenso en el pH observado?

En este artículo se valoran los cambios de pH y Brix en determinadas variedades de pimiento California a medida que progresa la maduración (acceso al artículo). ¿Siguen nuestros pimientos una evolución similar a la descrita en la bibliografía en cuanto al pH y al Brix?

Iniciamos los experimentos en nuestro laboratorio

Nuestro proyecto tiene este año dos facetas. Por un lado, se realizará un estudio microscópico de los frutos de pimiento, y por otro un estudio de determinados parámetros bioquímicos, comparándolos en función del grado de madurez de los mismos.

Hoy hemos iniciado los experimentos bioquímicos con pimientos de la variedad Melchor (California), verdes y rojos, preparando distintos tipos de extractos. Por un lado hemos obtenido jugo de los frutos mediante trituración y posterior prensado en una jeringa, en la que se ha introducido una gasa de nylon para su filtrado. En estos extractos determinaremos el contenido de azúcares solubles (º Brix) y el pH.

 

Se han obtenido extractos tamponados de frutos de pimiento para la determinación de proteínas y de vitamina C. Para ello se han triturado 6 gramos de frutos con 6 ml de tampón TRIS-HCl. Estos se han almacenado en el congelador para valoraciones posteriores.

Por último, se han preparados extractos etanólicos de los pimientos, triturando 1 g de pimientos con 10 ml de etanol al 96%. El objetivo de estos es determinar las concentraciones de clorofilas y carotenoides.

 

Además de los extractos, hemos podido hacer nuestras primeras determinaciones bioquímicas. Mediante el refractómetro hemos podido medir el contenido de azúcares solubles en los frutos obteniendo los siguientes valores:

Pimiento verde: 4 º Brix.

Pimiento rojo: 8 º Brix.

 

También hemos obtenido las primeras lecturas en el espectrofotómetro para valorar clorofilas y carotenoides. Estos últimos son indicadores del contenido de vitamina A de los pimientos. Se ha realizado tres medidas con los siguientes resultados:

Las ecuaciones que nos permiten calcular las concentraciones de pigmentos son las siguientes:

 

Clorofila a (µg/ml) = 13,36·A664 - 5,19·A649
Clorofila b (µg/ml) = 27,43 · A649 - 8,12 · A664
Carotenoides totales (µg/ml) = [(1000·A470 -2,13·(Clorofila a) - 97,64·(clorofila b)]/209

 

A partir de ellas y de los datos se puede calcular la concentración de los pigmentos. Hay que expresarla es microgramos de pigmento/gramo de fruto de pimiento. Para ello tenemos que tener en cuenta las diluciones.

Esperamos los resultados y el análisis de resultados de nuestra primera sesión en los comentarios.