Estudiamos la concentración de proteínas de nuestros extractos

El último estudio de nuestro proyecto va a ser evaluar si se afecta la concentración de proteínas en función del tiempo de almacenamiento de los pimientos en los distintos modos de conservación de los mismos. Las proteínas se han valorado mediante el método de Bradford (1996). Para ello se ha elaborado una curva patrón con cantidades conocidas de proteína. Hemos partido de una solución de proteínas con una concentración de 0,6 mg de proteínas por mililitro en agua destilada. Se han tomado los volúmenes crecientes que se indican en la tabla de abajo a los que se ha añadido agua destilada hasta completar un volumen de 800 microlitros. A esta solución se añaden 200 microlitros de reactivo de Bradford, hasta dar un volumen final de 1 ml. Se mezcla bien y se lee la absorbancia en el espectrofotómetro a 595 nm.

Los resultados se muestran en la tabla anterior, a partir de los cuales se ha calculado la absorbancia media. La representación gráfica de estos datos y la ecuación de la recta de regresión se muestran en la gráfica siguiente:

A partir de la ecuación de la recta podemos despejar la ecuación que nos permitirá calcular la concentración de proteínas en nuestras muestras.

 

Cantidad de proteínas (microgramos)  x = (y - 0,0281)/0,0642

Para valorar la cantidad de proteínas de nuestros extractos hemos puesto 5 microlitros de los mismos en un tubo ependorf, al que hemos añadido 795 microlitros de agua destilada y 200 microlitros de reactivo de Bradford. Se ha mezclado bien y a los diez minutos se ha procedido a la lectura de la absorbancia a 595 nm.

Los resultados se muestran en la siguiente tabla. Se han hecho tres determinaciones para cada extracto y se ha calculado el valor medio.

Con los datos de la tabla anterior, y utilizando la ecuación anterior, se puede calcular la concentración de proteínas en nuestros extractos. A partir de estos datos debemos calcular la cantidad de proteínas por gramo de pimiento fresco. Para ello hemos de tener en cuenta que el valor que obtengamos al aplicar la ecuación indica la cantidad de proteínas en 5 microlitros de extracto; a partir de aquí, estableciendo una proporción, calcularemos la cantidad en 1 mililitro de extracto. Considerando que hemos preparado los extractos triturando 3 g de pimiento en 3 ml de tampón TRIS, podremos tener la cantidad de proteínas por gramo de pimiento fresco.

Bradford M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: 248–254