Histología de nuestras variedades de pimiento: microscopía confocal

En la pasada visita a la Estación Experimental del Zaidín conocimos los fundamentos del microscopio confocal y Juan de Dios Alché obtuvo imágenes de pimientos frescos de las variedades California verde y rojo. En este tipo de microscopio observamos cortes frescos que fueron iluminados por luz láser de distintos colores obteniéndose imágenes sorprendentes en las que se muestra la luz que emiten las propias moléculas al ser excitadas por los láseres. Es un microscopio que funciona como un tomógrafo y va obteniendo cortes, que luego son integrados mediante un ordenador para dar imágenes muy vistosas que aportan una gran cantidad de información. A continuación se muestran algunas de las imágenes obtenidas por Juan de Dios Alché.

1. Pimientos de la variedad California verde fresco

Corte de la capa externa del pericarpo de pimiento California verde.

 

 

Corte de la capa externa del pericarpo de pimiento California verde.

Pimiento California verde, capa externa (proyección).

Semilla de pimiento California verde fresco.

2. Pimientos de la variedad California rojo fresco

Pericarpo de pimiento California rojo fresco. Corte individual.

 

Pericarpo de pimiento California rojo (proyección)

Pericarpo de pimiento California rojo (proyección)

Pericarpo de pimiento California rojo (proyección)

Pericarpo de pimiento California rojo (proyección)

Como podemos ver, las imágenes son completamente distintas a las que hemos obtenido mediante microscopía óptica tradicional. Aparecen colores que se deben a las emisiones de las propias moléculas que componen los pimientos. Y aunque nos quede muchísimo que aprender sobre este tipo de microscopía, sí que ya podemos ir haciendo alguna actividad, como comparar las estructuras en imágenes con ambos tipos de microscopía, identificar algunos orgánulos en estas últimas o plantearnos porqué aparecen manchitas de color rojo en las imágenes de pimientos verdes y de color verde en los pimientos rojos. Como sabéis, los comentarios en el blog.

Histología de nuestras variedades de pimientos (I): microscopía óptica

El año pasado fuimos conscientes de la poca bibliografía que existe sobre la histología de los frutos de los pimientos. Una parte de nuestro proyecto consistía en llenar este hueco y para ello Juan de Dios Alché y miembros de su equipo procesaron los pimientos y nos facilitaron una gran cantidad de cortes de la carne de los frutos, de la placenta, de las extensiones de la placenta y de las semillas. Hemos tomado imágenes y hemos hecho una serie de composiciones que faciliten su comparación. En algunas de ellas faltan algunas fotos que están pendientes de que confirmemos que realmente corresponden a esas estructuras.

La tarea que tenemos que afrontar es la comparación de las distintas estructuras que valoremos diferencias entre las distintas variedades de pimientos y los distintos estados de cada una de ellas. También es necesario que revisemos la bibliografía de modo que recopilemos trabajos de los que podamos obtener información acerca de estas estructuras.

1. Estructura histológica del pericarpo de pimiento

Cortes observados a 10X

Capas externas del pericarpo de los pimientos (40X)

Capas externas del pericarpo (colénquima) 40X.

Células parenquimáticas del pericarpo de pimiento (40X)

2. Estructura histológica de la placenta de pimiento

Cortes de placenta de las distintas variedades de pimientos (10X)

Cortes de placenta de las distintas variedades de pimientos (40X)

 

 

3. Estructura histológica de las extensiones de la placenta

Cortes de extensión de placenta (10X)

Cortes de extensión de placenta (40X)

4. Estructura histológica de la semillas de pimientos de distintas variedades

Cortes de semillas de las distintas variedades y estados de pimientos (10X)

Cortes de las distintas variedades y estados de pimientos (40X)

Microscopía en la Estación Experimental del Zaidín

Este miércoles hemos visitado los servicios de microscopía de la Estación Experimental del Zaidín dentro de las actividades del proyecto de los pimientos. Nos ha dedicado toda la mañana el doctor Juan de Dios Alché. Nuestro objetivo era por un lado conocer los fundamentos de la microscopía confocal y de observar la estructura de nuestros pimientos con estos instrumentos tan sofisticados. Y por otro lado teníamos del curso anterior una serie de cortes y preparaciones que se había realizado en la EEZ sobre distintas estructuras de dos variedades de pimientos sobre las que necesitábamos conocer detalles de los procedimientos de tinción y de montaje.

Hicimos dos grupos. El primero recibió explicaciones sobre diversos aspectos de la microscopía tradicional y procedimos a observar los cortes que teníamos. Se trata de secciones muy finas de una micra, por lo que algunos que parecían no estar teñidos en realidad lo estaban. Sobre ellos obtuvimos fotografías que nos serán enviadas más adelante. Tras recibir las explicaciones, el grupo continuo trabajando durante la primera parte de la mañana.

El doctor Juan de Dios Alché fotografiando cortes finos de placenta de pimiento.

El segundo grupo se dirigió con Juan de Dios al microscopio confocal. Recibimos en primer lugar unas explicaciones muy oportunas para comprender los principios del microscopio, cuya característica principal es la de ser un microscopio invertido capaz  de realizar cortes ópticos en muestras gruesas, lo cual es posible ya que ilumina con luz láser y aprovecha la fluorescencia propia de las moléculas que conforman las estructuras celulares. Tiene además la capacidad de integrar las imágenes y formar modelos tridimensionales. Se trabajó con cortes en fresco de los pimientos, observando unas imágenes en las que podían detectar estructuras como los cromoplastos.

A media mañana cambiamos los grupos, pasando los que habían estado en el microscopio confocal al óptico y viceversa. Las fotos de abajo muestran a algunos de nuestros compañeros observando y tomando imágenes de nuestros pimientos. Por su aspecto vemos que la ciencia también puede resultar divertida.

Cuando recibamos las imágenes de este día las presentaremos en ese blog. Pero mientras podemos hacer una reseña de lo que aprendimos en este día de microscopía y dejarla en los comentarios.

Completamos el estudio bioquímico de los pimientos. Datos globales

En este semana hemos concluido los experimentos bioquímicos con nuestros pimientos. Completamos los que llevamos a cabo en curso anterior con las variedades California Melchor y Alegría riojana con el análisis de pimientos de la variedad piquillo, bajo los mismos supuestos: frescos, senescentes y secos. Las tablas siguientes muestran los resultados de los cálculos llevados a cabo con las medidas. Recordaremos que no pudimos disponer pimientos alegría riojana senescentes ni desecados.

1. Valoración del pH de los extractos de pimientos

2. Valoración del contenido en azúcares solubles (º Brix)

3. Valoración del contenido de ácido ascórbico (vitamina C)

4. Análisis de las proteínas

5. Valoración de los pigmentos fotosintéticos

5.1. Variedad California

5.2. Variedad Alegría Riojana

5.3. Variedad Piquillo

De proyectos anteriores tenemos datos de la evolución de los parámetros que estudiamos en otra variedad de pimientos, la dulce italiano. En este caso estudiábamos cómo variaban estos parámetros bioquímicos en función del método de conservación de los pimientos. En el estudio actual consideramos senescentes a aquellos pimientos que almacenamos durante 12 días; en el caso de los pimientos dulces italianos, asimilaremos a los senescentes los medidos a los 14 días de almacenamiento. Incluimos a continuación los datos de entonces, con lo que podemos ampliar nuestro estudio a un total de cuatro variedades de pimientos.

Con todos estos resultados procede ahora hacer el análisis correspondiente. La representación gráfica de los mismos nos puede ayudar a su interpretación. Como siempre, compartiremos los nuestras conclusiones en los comentarios.

Nuevas determinaciones de parámetros bioquímicos en pimientos

 Retomamos nuestro proyecto sobre pimientos valorando algunos de los parámetros que nos quedaron pendientes e incorporando una nueva variedad a nuestro estudio, el pimiento de piquillo. En esta ocasión, las determinaciones que hemos hecho han sido las habituales (Brix, pH, proteínas, vitamina C y pigmentos fotosintéticos) en pimientos de piquillo verdes y rojos, frescos y senescentes (analizados doce días después de recibirlos en el laboratorio y almacenados a temperatura ambiente) y pimientos de la variedad alegría riojana rojos, tanto frescos como senescentes. Nos quedan pendientes algunas valoraciones como la de los pimientos alegría riojana verdes (aquí trabajaremos con muestras congeladas) y los pimientos del piquillo desecados.

Los resultados obtenidos de estos experimentos y con los que ya podemos ir trabajando se exponen en las tablas siguientes:

1. Valoración de los azúcares solubles (Brix)

2. Valoración de los cambios de pH.

3. Valoración de los cambios en el contenido de vitamina C (ácido ascórbico).

En esta ocasión, y a diferencia de experimentos anteriores, las determinaciones se han hecho con 0,5 ml de extractos de pimiento (hay que tener en cuenta este dato para los cálculos de concentración de ascorbato).

4. Determinación de proteínas

Las proteínas se han determinado por el método de Bradford, descrito en entradas anteriores.

5. Determinación de los cambios en la concentración de pigmentos fotosintéticos.

Es necesario considerar las diluciones que se han hecho para las lecturas. Estas afectan a las lecturas a 470 nm, en la zona de absorción de los carotenoides. 

En el caso de las lecturas a 649 y 664 nm,, los valores estaban próximos a 0 a las diluciones indicadas para los carotenoides, por lo que se valoraron sin diluir.

Una vez hechas las determinaciones procede hacer los cálculos pertinentes e ir sacando las conclusiones oportunas. Se presentarán en la zona de comentarios.

6. Concentraciones de vitamina C, proteínas y pigmentos

Las tablas siguientes muestran los valores de la concentración de vitamina C, de proteínas y de los distintos pigmentos ensayados en las distintas variedades y estados de los pimientos.

6.a. Vitamina C

 6.b. Proteínas

6c. Pigmentos fotosintéticos

Completamos los gráficos con los nuevos resultados

En la entrada anterior se mostraban los resultados obtenidos en los experimentos realizados el pasado viernes. Con ellos podemos completar los gráficos que presentamos en el III Congreso CAOS, en la EEZ. Ya tenemos completos los resultados de los pimientos de la variedad Melchor, tipo California, y es momento de interpretarlos. 

1. Cambios en la concentración de azúcares solubles (ºBrix)

 2. Cambios en los valores de pH

3. Cambios en la concentración de ascorbato (vitamina C)

4. Cambios en la concentración de proteínas

5. Cambios en la concentración de pigmentos

Nótese que en el caso del pimiento Alegría riojana la escala del eje de ordenadas es distinta a las de las otras variedades.

Es ahora momento de hacer la valoración de nuestros resultados. Nuestro proyecto continúa. A ver esos comentarios.

Resultados de las determinaciones bioquímicas en pimientos Melchor California desecados

Tras el congreso de la EEZ en el que presentamos nuestros resultados retomamos nuestro proyecto, pensando ya en la próxima edición del CAOS. Recordemos que el objetivo que nos trazamos para nuestro proyecto es comprobar como la senescencia o el secado de los pimientos les afecta a su aspecto histológico en el primer caso o a los parámetros bioquímicos en el segundo. Nos quedan aún pendientes unas medidas sobre los frutos de algunas variedades y en este experimento hemos analizado los parámetros que habitualmente calculamos en frutos de la variedad Melchor tipo California que hemos desecado en nuestro laboratorio.

El primer paso ha sido comprobar cuánta agua han perdido los pimientos en el proceso de desecación. Esta se ha hecho a temperatura ambiente. Mantenemos el estudio con el fruto verde y el fruto rojo. El peso inicial del primero fue de 221,5 g; una vez seco el peso fue de 11,5 g. En el caso del pimiento rojo, inicialmente pesó 212,4 g y una vez seco 23,7 g.  El pimiento verde contiene un 94,8% de agua; el rojo contiene un 88,8% de agua. Alternativamente, el peso seco es respectivamente de un 5,2% y de un 11,2% en ambos frutos.

Para reconstituir los pimientos se preparó un volumen de 40 ml de extracto; para ello se tomaron 2,1 g de pimiento verde, se trituró y le añadieron 37,9 ml de agua. En el caso de los pimientos rojos, a 4,5 g de pimiento seco triturado se le añadieron 35,5 ml de agua. Los tubos se mantuvieron en el frigorífico durante dos días para la rehidratación de los frutos y se procedió a los ensayos según las técnica habitualmente empleadas. 

Los resultados de los experimentos se muestran en las siguientes tablas.

Brix y pH

Vitamina C

Proteínas

Pigmentos

A partir de estos datos obtenidos es el momento de realizar los cálculos pertinentes para conocer los valores de los parámetros estudiados y compararlos con los que tenemos de los experimentos posteriores.